Übersicht

Referenz-Diagnostik am NZR für HIV und andere Retroviren
Bei der retroviralen Diagnostik geht es im wesentlichen um drei Fragestellungen:
  • Ist eine Person mit einem Retrovirus infiziert?
  • Falls ja, wie aktiv ist die Infektion, bzw. wie hoch ist die Viruskonzentration?
  • Was sind die genetischen und biologischen Eigenschaften von Viren?
Bei den Methoden der ersten beiden Bereiche wird zwischen direkten und indirekten Tests unterschieden. Direkte Tests weisen bestimmte Viruskomponenten nach, z.B. Virusproteine, virale DNA oder RNA. Mit diesen Tests kann neben diagnostischen Fragestellungen auch die Replikationsaktivität bei einer gesicherten Infektion beurteilt werden. Viruskomponenten werden auch bei der Virusanzucht in vitro nachgewiesen; dieses Verfahren untersucht zudem gleichzeitig die Vermehrungsfähigkeit des Virus. Die indirekten Tests machen sich die Immunantwort eines Infizierten zunutze, insbesondere die Produktion spezifischer Antikörper.
 
Zu den Viruscharakterisierungen gehören die Bestimmung des HIV-Subtyps und die Analyse von Resistenzen gegen antiretrovirale Medikamente. Nachfolgend werden die am NZR durchgeführten Methoden kurz beschrieben.
 
Beachte: Das NZR führt KEIN HIV-Screening durch (Ausnahme: pädiatrische HIV-Infektionen).
 
Uebersichtsarbeiten des NZR zur Diagnostik von Retroviren:
  1. Schüpbach J. Biologie und Diagnostik der HIV-Infektion. Labor und Medizin 1998; 25:204-209.
  2. Schüpbach J. Human Immunodeficiency Viruses. In: Manual of Clinical Microbiology, P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken eds., ASM PRESS, 7th edition, 1999, pp. 847-870.
  3. Schüpbach J. and Gallo R.C. Human Retroviruses. In: Clinical Virology Manual, Specter S., Hodinka R.L .and Young S.A. eds., ASM PRESS, 3rd edition, 2000, pp. 513-560
  4. Schüpbach J. Human Immunodeficiency Viruses. In: Manual of Clinical Microbiology, P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken eds., ASM PRESS, 8th edition, 2003, pp. 1253-1281.
  5. Schüpbach J. SHCS and the laboratory diagnosis of HIV infection - from the development of the HIV Western blot to virus quantification and clinically relevant individual virus characterization. Ther. Umsch. 61: 603-607, 2004.





Indirekte (Bestätigungs-) Tests zum Nachweis einer Infektion durch Retroviren
Western Blot (für HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2).
 
Dieses Verfahren ermöglicht den sensitiven Nachweis von Antikörpern gegen die verschiedenen Proteine eines Virus und wird weltweit als Bestätigungstest für retrovirale Infektionen eingesetzt. Für die Resultateauswertung bei HIV-1 existieren Empfehlungen von vier verschiedenen Organisationen, so von CDC (U.S. Centers for Disease Control), CRSS (U.S. Consortium for Retrovirus Serology Standardization), ARC (American Red Cross), FDA (U.S. Federal Drug Administration). Am NZR werden die HIV-1 Western Blots automatisch nach all diesen Kriterien ausgewertet. Ein positives Resultat nach den Kriterien des NZR erfordert Positivität nach mindestens drei der vier Empfehlungen.

Bei Erwachsenen sind Western Blots geeignet für die Bestätigung von Infektionen mit HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2. Bei pädiatrischen Infektionen ist der Nutzen beschränkt: Da maternale IgG über einen aktiven transplazentaren Transport in das kindliche Blut gelangen, wird das Resultat des IgG Western Blots im ersten Lebensjahr vorwiegend durch die Präsenz dieser maternalen Antikörper bestimmt. Für Kinder von HIV-positiven Müttern stützt sich die HIV-Diagnostik daher fast ausschliesslich auf direkte Virusnachweistests ab.

Line Immunoassay InnoLia HIV-I/II Score.

Bei den Screeningtests auf ELISA-Basis hat die Verwendung von rekombinanten HIV-Proteinen als Testantigen zu wesentlichen Verbesserungen in der Sensitivität und Spezifität geführt (sog. "Tests der 2. Generation"). Die Verwendung von rekombinanten Proteinen oder synthetischen Peptiden in definierter Konzentration müsste auch bei den Western Blots zu vergleichbaren Verbesserungen führen, doch wurde diese Möglichkeit von der diagnostischen Industrie kaum realisiert. Eine Ausnahme ist der InnoLia HIV-I/II Score Test der Fa. Innogenetics, den wir seit 2004 vermehrt für die Bestätigung und die Differenzierung von HIV-1 und HIV-2 Infektionen einsetzen.
 
Originalarbeiten von NZR-MitarbeiterInnen zur Entwicklung und Anwendung des Western Blot für die Diagnostik von Retroviren:
  1. Schüpbach, J., Popovic, M., Gilden, R.V., Gonda, M.A., Sarngadharan, M.G., & Gallo, R.C. Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science 224: 503-505, 1984.
  2. Sarngadharan, M.G., Popovic, M., Bruch, L., Schüpbach, J., & Gallo, R.C. Antibodies reactive with human T-Lymphotropic retroviruses (HTLV-III) in the serum of patients with AIDS. Science 224: 506-508, 1984.
  3. Safai, B., Sarngadharan, M.G., Groopman, J.E., Arnett, K., Popovic, M., Slisky, A., Schüpbach, J., & Gallo, R.C. Seroepidemiological studies of HTLV-III in AIDS. Lancet June 30 1(8392): 1438-1440, 1984.
  4. Schüpbach, J., Haller, O., Vogt, M., Lüthy, R., Oelz, O., Joller, H., Sarngadharan, M.G., & Gallo, R.C. Antibodies to HTLV-III in Swiss patients with AIDS, pre-AIDS, and in groups at risks for AIDS. N. Engl. J. Med. 312: 265-270, 1985.
  5. Schüpbach, J., Vogt, M., Bhushan, R., Lüthy, R., Haller, O., Joller, H., Ferber, T., Büchner, S., Schuppli, R., Schädelin, J., Hirschel, B., Cruchaud, A., Stroun, J., Frei, P., & Glauser, M.P. Prävalenz von Antikörpern gegen HTLV-III in verschiedenen Regionen der Schweiz. Schweiz. med. Wschr. 115: 1048-1054, 1985.
  6. Resnick, L., di Marzo-Veronese, F., Schüpbach, J., Tourtellotte, W.W., Ho, D.D., Müller, F., Shapshak, P., Vogt, M., Groopman, J.E., Markham, P.D., & Gallo, R.C. Intra-blood-brain-barrier synthesis of HTLV-III specific IgG in patients with AIDS or AIDS-related complex. N. Engl. J. Med. 313: 1498-1504, 1985.
  7. Schüpbach, J., and Tanner, M. Specificity of human immunodeficiency virus (LAV/HTLV-III)-reactive antibodies in African sera from southeastern Tanzania. Acta Tropica 43: 195-206, 1986.
  8. Schüpbach, J., Baumgartner, A., & Tomasik, Z. HTLV-1 in Switzerland: Low prevalence of specific antibodies in HIV risk groups, high prevalence of cross-reactive antibodies in normal blood donors. Int. J. Cancer 42: 857-862, 1988.
  9. Schüpbach, J., Wunderli, W., Kind, C., Kernen, R., Baumgartner, A., & Tomasik, Z. Frequent detection of HIV- and IgG-specific IgM and IgA antibodies in HIV-positive cord blood sera: fine analysis by Western blot. AIDS 3: 583-589, 1989.
  10. Schüpbach J, Tomasik Z, Jendis J, Böni J, Seger R, Kind C. IgG, IgM and IgA seroconversion to HIV in infants born to HIV-1 infected mothers. J. AIDS 1994; 7:421-427.
  11. Böni J, Bisset LR, Burckhardt JJ, Joller-Jemelka HI, Bürgisser P, Perrin L, Gorgievski M, Erb P, Fierz W, Piffaretti J-C, Schüpbach J. Prevalence of human T-cell leukemia virus (HTLV) types I and II in Switzerland. J. Med. Virol. 2004 ; 72:328-37.





Direkte Tests zum Nachweis einer Infektion durch Retroviren
A. Ultrasensitiver Antigen-Test für HIV-1 p24.
 
Bei Vorliegen von HIV-spezifischen Antikörpern ist der Nachweis infolge der Bildung von Immunkomplexen (p24/anti-p24) erschwert (underdetection). Immunglobulin-spezifische Antikörper mit Aehnlichkeit zu Rheumafaktoren stellen ein weiteres Problem dar, da sie zu hohe Konzentrationen ergeben (overdetection). Mit einer am NZR entwickelten einfachen, aber hocheffizienten Methode (fünfminütiges Kochen der verdünnten Plasmaprobe) werden alle interferierenden Antikörper eliminiert, Immunkomplexe irreversibel zerstört und p24 quantitativ freigesetzt, so dass es danach mit einem ELISA in seiner wahren Konzentration nachgewiesen werden kann. Dafür wird ein sehr sensitives, mit einer Signalamplifikation verbundenes Verfahren eingesetzt. Bei Verwendung von 50 µL Plasma liegt die Detektionsgrenze des Tests etwa bei 0.5 pg/mL.

Positive Resultate von Antigentests, die zu diagnostischen Zwecken durchgeführt werden, werden durch einen Neutralisationstest bestätigt (>50% Neutralisation = positiv), wodurch eine praktisch 100%ige Spezifität erreicht wird. Die Sensitivität bei Verwendung von 50 µL Plasmaproben betrug in einer retrospektiven Studie an adulten HIV-1-Infizierten aller Stadien 97.8% und war der RNA PCR mit einer Detektionsgrenze von 400 Kopien/mL ebenbürtig. Auch bei pädiatrischen HIV-Infektionen ist das Verfahren diagnostisch ebenso sensitiv wie die PCR (100% diagnostische Sensitivität > 10 Tage.; 50% <10 Tage). Mit der konsequent durchgeführten Neutralisation wird zudem eine praktisch 100%ige Spezifität erreicht. Bei neugeborenen Kindern in der ersten Lebenswoche ist bei isoliertem positivem Resultat des Antigentests (bei gleichzeitig negativer DNA- und RNA-PCR) Vorsicht geboten; nicht-infektiöses p24 könnte in immunkomplexierter Form zusammen mit den IgG Antikörpern der Mutter transplazentar in das Kind transportiert oder durch Microtransfusionen, die nicht unbedingt zu einer Infektion führen müssen, in den klindlichen Kreislauf gelangt sein.
 
NZR-Publikationen zur Entwicklung und Anwendung von HIV-1 p24 Antigen-Tests:
  1. Schüpbach J and Böni J. Quantitative and sensitive detection of immune-complexed and free HIV antigen after boiling of serum. J. Virol. Methods 1993; 43:247-256.
  2. Schüpbach J, Böni J, Tomasik Z, Jendis J, Seger R, Kind C, and the Swiss Neonatal HIV Study Group. Sensitive detection and early prognostic significance of antigen p24 in heat-denatured plasma of human immunodeficiency virus type 1-infected infants. J. Infect. Dis. 1994; 170:318-324.
  3. Schüpbach J, Flepp M, Pontelli D, Tomasik Z, Lüthy R, Böni J. Heat-mediated immune complex dissociation and ELISA signal amplification render antigen p24 detection in plasma as sensitive as HIV-1 RNA detection by polymerase chain reaction. AIDS 1996; 10:1085-1090.
  4. Böni J, Opravil M, Tomasik Z, Rothen M, Bisset L, Grob PJ, Lüthy R, Schüpbach J. Simple monitoring of antiretroviral therapy with a signal-amplification–boosted human immunodeficiency virus type 1 p24 antigen assay with heat-denatured plasma. AIDS 1997; 11:F47-F52.
  5. Schüpbach J, Böni J. Sensitivity of heat-denatured p24 antigen in the diagnosis of pediatric HIV infection. J. AIDS Hum. Retrovirol. 1998;18:399-400.
  6. Nadal D, Böni J, Kind C, Varnier OE, Steiner F, Tomasik Z, Schüpbach J. Prospective evaluation of amplification–boosted ELISA for heat-denatured p24 antigen for diagnosis and monitoring of paediatric HIV-1 infection. J. Infect. Dis. 1999;180:1089-1095.
  7. Schüpbach J and Varnier OE. HIV-1 p24 antigen - a sensitive and precise, yet inexpensive alternative to PCR for viral DNA or RNA. International AIDS Society Newsletter Nr. 15, April 2000, 9-10.
  8. Schüpbach J, Tomasik Z, Nadal D, Flepp M, Ledergerber B, Opravil M, Böni J. Use of HIV-1 p24 as a sensitive, precise and inexpensive marker for infection, disease progression and treatment failure. Int. J. Antimicrob. Agents 2000; 16: 441-445.
  9. Ledergerber B, Flepp M, Böni J, Tomasik Z, Lüthy R and Schüpbach J. HIV-1 p24 concentration measured by boosted ELISA of heat-denatured plasma correlates with CD4+ decline, progression to AIDS and survival: Comparison with viral RNA. J. Infect. Dis. 2000; 181:1280-1288.
  10. Schüpbach J, Böni J, Flepp M, Tomasik Z, Joller H, Opravil M. Antiretroviral treatment monitoring with an improved HIV-1 p24 antigen test: an inexpensive alternative to tests for viral RNA. J. Med. Virol. 2001; 65:225-232.
  11. Schüpbach J. Measurement of HIV-1 p24 antigen by signal-amplification-boosted ELISA of heat-denatured plasma is a simple and inexpensive alternative to tests for viral RNA. AIDS Rev. 2002;4(2):83-92.
  12. Sterling TR, Hoover DR, Astemborski J, Vlahov D, Bartlett JG, Schüpbach J. Prognostic value of heat-denatured HIV-1 p24 antigen and correlation with plasma HIV-1 viral load and CD4+ T-lymphocyte level in adults. J. Infect. Dis. 2002; 186:1181-1185.
  13. Schüpbach J, Böni J, Bisset LR, Tomasik Z, Fischer M, Günthard H, Ledergerber B, Opravil M for the Swiss HIV Cohort Study. HIV-1 p24 antigen is an independent correlate of CD4 T-cell change in patients on successful long-term antiretroviral therapy. J. AIDS 2003; 33:292-299.
  14. Ribas SG, Ondoa P, Schüpbach J, van der Groen G, Fransen K. Performance of a quantitative human immunodeficiency virus type 1 p24 antigen assay on various HIV-1 subtypes for the follow-up of human immunodeficiency type 1 seropositive individuals. J. Virol. Methods 2003; 113:29-34.
  15. Schüpbach J. Viral RNA and p24 antigen as markers of HIV disease and antiretroviral treatment success. Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 132:196-209.
  16. Schüpbach J, Günthard H, Joos B, Fischer M, Böni J, Tomasik Z, Yerly S., Perrin L, Battegay M, Furrer H, Vernazza P, Bernasconi E, Hirschel B. HIV-1 p24 may persist during long-term highly active antiretroviral therapy, increases little during short treatment breaks, and its rebound after treatment stop correlates with CD4+ T cell loss. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2005; 40:250–256.
  17. Jennings C, Fiscus SA, Crowe SM, Danilovic AD, Morack RJ, Scianna S, Cachafeiro A, Brambilla DJ, Schüpbach J, Stevens W, Respess R, Varnier OE, Corrigan GE, Gronowitz JS, Ussery MA, Bremer JW. Comparison of two human immunodeficiency virus (HIV) RNA surrogate assays to the standard HIV RNA assay. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:5950-5956.
  18. Knuchel MC, Tomasik Z, Speck RF, Luthy R, Schüpbach J. Ultrasensitive quantitative HIV-1 p24 antigen assay adapted to dried plasma spots to improve treatment monitoring in low-resource settings. J. Clin. Virol. 2006; 36:64-67.
  19. Brinkhof MWG, Böni J, Steiner F, Tomasik Z, Nadal D, Schüpbach J. Evaluation of p24-based antiretroviral treatment monitoring in pediatric HIV-1 infection: prediction of the CD4+ T cell changes between consecutive visits. J. Acquir. Imm. Defic. Syndr. 2006; 41:557-562.
  20. Schüpbach J, Tomasik Z, Knuchel M, Opravil M, Gunthard HF, Nadal D, Böni J. Optimized virus disruption improves detection of HIV-1 p24 in particles and uncovers a p24 reactivity in patients with undetectable HIV-1 RNA under long-term HAART. J. Med. Virol. 2006;78:1003-1010.
  21. Tehe A, Maurice C, Hanson DL, Borget MY, Abiola N, Maran M, Yavo D, Tomasik Z, Böni J, Schüpbach J, Nkengasong JN. Quantification of HIV-1 p24 by a highly improved ELISA: an alternative to HIV-1 RNA based treatment monitoring in patients from Abidjan, Cote d'Ivoire. J. Clin. Virol. 2006;37:199-205.
  22. Knuchel MC, Jullu B, Shah C, Tomasik Z, Stoeckle MP, Speck RF, Nadal D, Mshinda H, Böni J, Tanner M, Schüpbach J. Adaptation of the ultrasensitive HIV-1 p24 antigen assay to dried blood spot testing. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2007;44:247-253.


B. DNA-PCR (für HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2).

Nachweis von viraler DNA, d.h. zellassoziiertem Virus, mittels Polymerase Chain Reaction. Bei diesem Verfahren wird die virus-spezifische DNA in einer Kettenreaktion selektiv amplifiziert und das Amplifikationsprodukt mit einem auf der Hybridisierung spezifischer Sonden basierenden Verfahren (ELISA oder TaqMan Technologie) analysiert. Zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität der Methode können mehrere Regionen des jeweiligen viralen Genoms analysiert werden.

Die Detektionsgrenze der am NZR durchgeführten DNA-PCR gegen alle menschlichen Retroviren liegt bei 1 Kopie/Reaktion. Für HIV-1 beträgt die Spezifität eines positiven Resultats 100%; die diagnostische Sensitivität in HIV-positiven Erwachsenen beträgt 96-98%. Bei pädiatrischen HIV-Infektionen (Kinder > 10 Tage) betrug die in einer prospektiven Studie erhobene diagnostische Sensitivität 100%. Für andere Retroviren kann wegen der in der Schweiz niedrigen Prävalenz bisher keine aussagekräftige Statistik erhoben werden.

Für die Bestätigung von Infektionen mit HIV-2, HTLV-1 und HTLV-2 ist die DNA-PCR die Methode der Wahl.


C. MEGA-PCR für HIV-1 DNA.

Auf dem Gebiet der HIV-Diagnostik zeigen einfache Berechnungen, dass auch bei der maximal erreichbaren analytischen Sensitivität der PCR von einer einzigen Kopie bei einem negativen Resultat dieser Untersuchung immer noch Millionen von HIV-infizierten Zellen im Immunsystem vorhanden sein können. Eine weitere wesentliche Steigerung der Sensitivität der DNA-PCR wurde durch unsere Entwicklung der sog. MEGA-PCR realisiert. Die analytische Detektionsgrenze dieser Methode liegt bei 2-4 Kopien von HIV-1 DNA in einer Probe von maximal 500 µg DNA. Verglichen mit 1 Kopie in 1 µg DNA bei der Standard-PCR bedeutet dies eine 125- bis 250-fache Steigerung der analytischen Sensitivität. Das Verfahren eignet sich zur Bestätigung von Infektionen mit sehr geringem Virusbefall bei Erwachsenen. Bei Kindern ist sie wegen der Schwierigkeit, grosse Blut-proben zu asservieren, von beschränktem praktischem Wert. Die Methode eignet sich auch zur Untersuchung von Gewebeproben.

Eine MEGA-PCR wurde am NZR auch für den Nachweis tierischer Retroviren entwickelt. Wichtig im Zusammenhang mit der Xenotransplantation, bei welcher tierische Gewebe/Organe (insbesondere des Schweins) auf den Menschen transplantiert werden, ist die MEGA-PCR für PERV, das porzine endogene Retrovirus. Dieser Test wurde am NZR für die virologische Ueberwachung von xenotransplantierten Patienten und ihrer Kontaktpersonen im Rahmen künftiger klinischer Studien entwickelt.

Für die Veterinärmedizin wurde eine MEGA-PCR für den Nachweis von Lentiviren von Schafen und Ziegen (SRLV, small ruminant lentiviruses) entwickelt.


D. RNA-PCR für HIV-1, HIV-2 (HTLV-1, HTLV-2).

Im Unterschied zur DNA-PCR dient die RNA-PCR dem Nachweis von Viruspartikeln in den verschiedenen Körperflüssigkeiten oder von intrazellulärer viraler RNA. Die am NZR entwickelte Methode garantiert den Nachweis von 5-10 RNA-Kopien. Bei HTLV-1 und HTLV-2 ist dieser Test diagnostisch nicht sinnvoll, da diese Infektionen in der Regel nicht mit einer Virämie einhergehen.

a. HIV-1 Virus Load (RNA-Konzentration im Plasma). Die Quantifizierung von HIV-RNA im Plasma (Viral Load Bestimmung zur Beurteilung der Prognose, Therapieindikation bzw. des Therapieerfolgs) gehört heute zu den Standarduntersuchungen im Rahmen der Betreuung von HIV-Patienten. Am NZR arbeiten wir standardmässig mit einer Plasmaprobe von 200 µL. Dieses Volumen steht in der Regel auch bei Proben von kleinen Kindern zur Verfügung, bei welchen die Entnahme grosser Proben problematisch ist. Bei diesem Volumen und der von uns eingesetzten Methodologie unter Verwendung des Roche Amplicor HIV-1 Monitor Tests (Version 1.5) liegt die garantierte Grenze für die Quantifizierbarkeit bei 25-50 Kopien/mL. Häufig sind aber auch niedrigere Konzentrationen nachweisbar. Eine weitere Senkung der Detektionsgrenze kann durch Vergrösserung des untersuchten Probenvolumens erreicht werden. Die Präzision dieser Methode liegt innerhalb eines Faktors von 3 bzw. eines halben log10.

b. Virus Load bei HIV-Isolaten, die von kommerziellen Tests nicht erkannt werden. Obwohl der Roche Amplicor HIV-1 Monitor Tests (Version 1.5) bezüglich der Erkennung divergenter Subtypen genenüber früheren Versionen deutlich verbessert worden ist, gibt es nach wie vor HIV-Isolate, die mit diesem Test nur ungenügend quantifiziert werden können. Systematisch nicht erfasst werden Viren des Gruppe O sowie HIV-2. Aber auch bei den verschiedenen Subtypen der Gruppe M (Subtypen A-K) kann es gelegentlich Isolate geben, bei denen eine zu geringe Konzentration gemessen wird. Ein Verdacht auf eine solche Situation ist dann vorhanden, wenn trotz stets niedriger HIV RNA-Konzentrationen im Plasma eine klinische Progredienz dokumentiert ist oder bereits ein fortgeschrittenes Stadium vorliegt. In diesen Fällen kann eine Untersuchung mit dem PERT Assay, welcher die HIV-Partikel aufgrund der in ihnen enthaltenen Reversen Transcriptase quantifiziert und vollkommen Sequenz-unabhängig ist, behelfsmässig für die Bestimmung der Partikelkonzentration eingesetzt werden (s. unten).

NZR-Publikationen zur Weiterentwicklung und Anwendung von PCR-Tests :

  1. Böni J and Schüpbach J. Primer extension analysis provides a sensitive tool for the identification of PCR-amplified DNA from HIV-1. J. Virol. Methods 1993; 42:309-322.
  2. Böni J, Leib SL, Emmerich B, Wiestler OD, Schüpbach J, Kleihues P. PCR identification of viral DNA in brain tissue of patients with HIV-1 encephalopathy. Neurology 1993;43:1813-1817.
  3. Böni J and Schüpbach J. Sensitive and quantitative detection of PCR-amplified HIV-1 DNA products by an enzyme linked immunoassay following solution hybridization with two differently labeled oligonucleotide probes. Mol. Cell. Probes 1993; 7:361-371.
  4. Günthard HF, Gowland P, Schüpbach J, Fung MSC, Böni J, Liou R-S, Chang NT, Grob P, Graepel P, Braun DG, Lüthy R. A phase I/IIA clinical study with a monoclonal chimeric mouse/human antibody to the V3 loop of HIV-1 gp120. J. Infect. Dis. 1994;170:1384-1393.
  5. Schüpbach J, Böni J, Tomasik Z, Jendis J, Seger R, Kind C and the Swiss Neonatal HIV Study Group. Sensitive detection and early prognostic significance of antigen p24 in heat-denatured plasma of human immunodeficiency virus type 1-infected infants. J. Infect. Dis. 1994; 170:318-324.
  6. Böni J. PCR detection of HIV. Methods in Mol. Biol. 1996;50:93-107.
  7. Nadal D, Böni J, Kind C, Varnier OE, Steiner F, Tomasik Z, Schüpbach J. Prospective evaluation of amplification–boosted ELISA for heat-denatured p24 antigen for diagnosis and monitoring of paediatric HIV-1 infection. J. Infect. Dis. 1999;180:1089-1095.
  8. Ledergerber B, Flepp M, Böni J, Tomasik Z, Lüthy R and Schüpbach J. HIV-1 p24 concentration measured by boosted ELISA of heat-denatured plasma correlates with CD4+ decline, progression to AIDS and survival: Comparison with viral RNA. J. Infect. Dis. 2000; 181:1280-1288.
  9. Bisset LR, Bosbach S, Tomasik Z, Lutz H, Schüpbach J, Böni J. Quantification of in vitro retroviral replication using a one-tube real-time RT-PCR system incorporating direct RNA preparation. J. Virol. Methods. 2001; 91:149-55.
  10. Shah CA, Böni J, Bisset LR, Seebach JD, Schüpbach J. Ultra-sensitive and specific detection of porcine endogenous retrovirus (PERV) using a sequence-capture real-time PCR approach. J. Virol. Methods 2003; 109:209-216.
  11. Böni J, Shah C, Flepp M, Luthy R, Schüpbach J. Detection of low copy numbers of HIV-1 proviral DNA in patient PBMCs by a high-input, sequence-capture PCR (Mega-PCR). J. Med. Virol. 2004; 72:1-9.
 
E. PERT Assay (Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay; erfasst alle infektiösen Retroviren).

Dieser am NZR entwickelte Test ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung sämtlicher infektiöser Retroviren mittels des in den Viruspartikeln enthaltenen Enzyms Reverse Transcriptase. Der Test ist etwa gleich sensitiv wie die RNA-PCR (400 Kopien/mL) und wird in Fällen eingesetzt, in welchen eine Infektion mit einem durch die üblichen Tests nicht erfassbaren HIV oder einem noch unbekannten Retrovirus vermutet wird. Mögliche Untersuchungsmaterialien sind Plasma (–70°C), Liquor cerebrospinalis und andere Körperflüssigkeiten. Der PERT Assay kann auch zur Kontrolle biomedizinischer Produkte (Vakzinen, Gerinnungspräparate etc.) bezüglich Retrovirusfreiheit eingesetzt werden. Es können nur die Retrovirus-Partikel, nicht aber nichtexprimierte Proviren detektiert werden.

NZR-Publikationen zum PERT Assay:
  1. Pyra H, Böni J, and Schüpbach J. Ultrasensitive retrovirus detection by a reverse transcriptase assay based on product enhancement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:1544-1548.
  2. Böni J, Pyra H, Schüpbach J. Sensitive detection and quantification of particle-associated reverse transcriptase in plasma of HIV-1 infected individuals by the product-enhanced reverse transcriptase assay. J. Med. Virol. 1996; 49:23-28.
  3. Schüpbach J, Pyra H, Jendis J., Tomasik Z, Böni J. Isolation of an in vitro transmissible agent with reverse transcriptase activity from a blood donor with a borderline-positive HIV-1 serology for more than five years. Clin. Diagn. Virol. 1996; 5: 197-203.
  4. Böni J, Stalder J, Reigel F, Schüpbach J. Detection of reverse transcriptase activity in live attenuated virus vaccines. Clin. Diagn. Virol. 1996; 5:43-53.
  5. Weissmahr RN, Schüpbach J, Böni J. Reverse transcriptase activity in chicken embryo fibroblast culture supernatants is associated with particles containing endogenous avian retrovirus EAV-0 RNA. J. Virol. 1997; 71: 3005-3012.
  6. Conrad B, Weissmahr RN, Böni J, Arcari R, Schüpbach J, Mach B. A human endogenous retroviral superantigen as candidate autoimmune gene in type 1 diabetes. Cell 1997; 90:303-313.
  7. Böni J and Schüpbach J. Reverse transcriptase assay based on product enhancement for assessing the drug susceptibility of retroviruses. In: Methods in Molecular Medicine, vol. 24: Antiviral Methods and Protocol. D. Edited by: D. Kinchington and R.F. Schinazi. HUMANA PRESS, Totowa NJ. 1999, pp.301-312.
  8. Bürgisser P, Vernazza P, Flepp M, Böni J, Tomasik Z, Hummel U, Pantaleo G, Schüpbach J and the Swiss HIV Cohort Study. Performance of five different assays for the quantification of viral load in subjects infected with various subtypes of HIV-1. J. AIDS 2000; 23:138-144.
  9. Deichmann M, Huder JB, Kleist C, Naher H, Schüpbach J, Böni J. Detection of reverse transcriptase activity in human melanoma cell lines and identification of a murine leukemia virus contaminant. Arch. Dermatol. Res. 2005; 296:345-352.


F. Viruskultur (für alle infektiösen Retroviren).

Das Untersuchungsmaterial wird in vitro kultiviert und die Kulturüberstände werden 2x wöchentlich mit dem PERT Assay untersucht. Bei Verdacht auf HIV-Infektion wird zusätzlich der HIV-1 p24 Antigentest eingesetzt. Ein positives Resultat erfordert, dass mindestens zwei unabhängig entnommene Ueberstände mit einem oder beiden dieser Tests positiv waren. Die Kulturen werden über maximal 4 Wochen geführt. Mit einer diagnostischen Sensitivität von 75-80% ist die HIV Viruskultur der PCR und dem Antigentest deutlich unterlegen. Am NZR wird sie deshalb nur noch durchgeführt, wenn nach einem anderen Retrovirus als HIV gesucht wird.

NZR-Publikationen zum Viruskultur:

  1. Jendis JB, Tomasik Z, Hunziker U, Nadal D, Seger R, Wetzel J-C, Kind C, Schüpbach J. Evaluation of diagnostic tests for HIV infection in infants born to HIV-infected mothers in Switzerland. AIDS 1988; 2:273-279.
  2. Schüpbach J, Jendis JB, Bron C, Böni J, Tomasik Z. False-positive HIV-1 virus cultures using whole blood. AIDS 1992; 6:1545-1546.
  3. Schüpbach J, Pyra H, Jendis JB, Tomasik Z, Böni J. Isolation of an in vitro transmissible agent with reverse transcriptase activity from a blood donor with a borderline-positive HIV-1 serology for more than five years. Clin. Diagn. Virol. 1996; 5: 197-203.
  4. Seemayer CA, Kolb SA, Neidhart M, Ohshima S, Gay RE, Michel BA, Gay S, Böni J, Schüpbach J. Absence of inducible retroviruses from synovial fibroblasts and synovial fluid cells of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2002; 46:2811-3.
  5. Seemayer CA, Böni J, Steiger J, Schüpbach J, Mihatsch MJ. No indication for activation of exogenous retroviruses in patients with renal allograft rejection. Clin. Nephrol. 2006; 65:324-7.





Charakterisierung von Viren
A. HIV-Subtypenbestimmung.
 
Aus EDTA-Blut werden die mononukleären Zellen isoliert, die DNA daraus extrahiert und ein 0.7 kb langes HIV-spezifisches Fragment aus der Region C2-V5 des HIV env Gens mittels "nested PCR" amplifiziert. Die Subtypenzuweisung erfolgt durch Sequenzanalyse und Vergleich mit Referenzsequenzen der verschiedenen bekannten Subtypen (Subtypen A-H, J, K der Gruppe M, Subtypen der Gruppen O und N) und zirkulierenden rekombinanten Formen (CRF).


B. Phylogenetische Analyse.

Diese wird hauptsächlich im Rahmen forensischer Untersuchungen eingesetzt, wobei es um die Frage geht, ob jemand HIV auf eine Drittperson übertragen hat. Für die Untersuchung wird DNA aus den mononuklären Zellen des oder der Geschädigten, des Angeklagten sowie einer Reihe weiterer Kontrollen aus dem geographischen Umfeld der Probanden isoliert. Wie bei der HIV-Subtypenbestimmung wird ein 0,7 kb langes HIV Fragment aus der Region C2–V5 des HIV env Gens mittels "nested PCR" amplifiziert und sequenziert. Die Verwandtschaftsanalyse erfolgt unter Verwendung der Software Produkte Megaline, Clustal W oder PAUP und umfasst verschiedene Algorithmen.

Bei wissenschaftlichen Untersuchungen im Bereich der Veterinärmedizin wurden phylogenetische Analysen bei Retroviren von Schafen und Ziegen sowie von Schlangen durchgeführt.


C. Genotypische Resistenzanalyse für HIV-1 (Resistenz gegen antiretrovirale Medikamente).

Virale RNA wird aus dem Plasma extrahiert. Der Bereich des pol Gens, welcher für die Reverse Transcriptase und die Protease kodiert, wird revers transcriptiert und mit PCR amplifiziert. Das Produkt wird mit PCR Population Sequencing analysiert. Die ermittelte Sequenz wird mittels Internet-gestützten Algorithmen auf Mutationen untersucht, die mit Resistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten assoziiert sind. Der Untersuchungsbericht enthält eine Liste der vorgefundenen Resistenzmutationen sowie ein Rating des Virus bezüglich der Sensitivität gegenüber den gebräuchlichen antiretroviralen Medikamenten.

NZR-Publikationen zum Thema:
  1. J. Schüpbach, L. Perrin, P. Bürgisser, L. Matter, W. Fierz, P. Erb, J.C. Piffaretti, P. Grob, J. J. Burckhardt und Sektion virale Krankheiten und Sentinellasysteme des BAG. Verbreitung von HIV-Subtypen in der Schweiz 1996-1998. BAG Bulletin Nr. 5 (1. Feb. 1999): 97-101.
  2. Böni J, Pyra H, Gebhardt M, Perrin L, Bürgisser P, Matter L, Fierz W, Erb P, Piffaretti J-C, Minder E, Grob P, Burckhardt JJ, Zwahlen M and Schüpbach J. High frequency of non-B subtypes in newly diagnosed HIV-1 infections in Switzerland. J. AIDS 1999; 22:174-179.
  3. Bürgisser P, Vernazza P, Flepp M, Böni J, Tomasik Z, Hummel U, Pantaleo G, Schüpbach J and the Swiss HIV Cohort Study. Performance of five different assays for the quantification of viral load in subjects infected with various subtypes of HIV-1. J. AIDS 2000; 23:138-144.
  4. Huder JB, Böni J, Hatt J-M, Lutz H, Schüpbach J. Identification and characterization of two closely related unclassifiable endogenous retroviruses in pythons (Python molurus and P. curtus). J. Virol. 2002 76:7607-7615.
  5. Hasse B, Hummel Y, Böni J, Schüpbach J, Flepp M, Gunthard HF. 25-jähriger therapienaiver Patient mit einem dreiklassenresistenten HI-Virus. Praxis 2003; 92:601-5.
  6. Haupts S, Ledergerber B, Böni J, Schüpbach J, Kronenberg A, Opravil M, Flepp M, Speck RF, Grube C, Rentsch K, Weber R, Gunthard HF. Impact of genotypic resistance testing on selection of salvage regimen in clinical practice. Antivir. Ther. 2003 8:443-54.
  7. Shah C, Böni J, Huder JB, Vogt HR, Muhlherr J, Zanoni R, Miserez R, Lutz H, Schüpbach J. Phylogenetic analysis and reclassification of caprine and ovine lentiviruses based on 104 new isolates: evidence for regular sheep-to-goat transmission and worldwide propagation through livestock trade. Virology 2004; 319:12-26.
  8. Shah C, Huder JB, Böni J, Schonmann M, Muhlherr J, Lutz H, Schüpbach J. Direct evidence for natural transmission of small-ruminant lentiviruses of subtype A4 from goats to sheep and vice versa. J. Virol. 78:7518-22.
  9. Joos B, Trkola A, Fischer M, Kuster H, Rusert P, Leemann C, Böni J, Oxenius A, Price DA, Phillips RE, Wong JK, Hirschel B, Weber R, Gunthard HF. Low human immunodeficiency virus envelope diversity correlates with low in vitro replication capacity and predicts spontaneous control of plasma viremia after treatment interruptions. J. Virol. 2005; 79:9026-9037.
  10. Simcock M, Sendi P, Ledergerber B, Keller T, Schüpbach J, Battegay M, Gunthard HF. A longitudinal analysis of healthcare costs after treatment optimization following genotypic antiretroviral resistance testing: does resistance testing pay off? Antivir. Ther. 2006; 11:305-14.
  11. Böni J, Schüpbach J, Rickenbach M. Rabbit retrotransposon sequences undetectable in blood donors and lymphoma patients of the Swiss HIV Cohort Study. AIDS Res. Hum. Retrovir. 2006; 22:499-500.
  12. Sendi P, Günthard HF, Simcock M, Ledergerber B, Schüpbach J, Battegay M. Cost-effectiveness of genotypic antiretroviral resistance testing in HIV-infected patients with treatment failure. PLoS One 2007; 2:e173.
  13. Joos B, Fischer M, Schweizer A, Kuster H, Boni J, Wong JK, Weber R, Trkola A, Gunthard HF. Positive in vivo selection of the HIV-1 envelope protein gp120 occurs at surface-exposed regions. J. Infect. Dis. 2007; 96:313-20.
  14. Yerly S, von Wyl V, Ledergerber B, Böni J, Schüpbach J, Bürgisser P, Klimkait T, Rickenbach M, Kaiser L, Günthard HF, Perrin L. Transmission of HIV-1 drug resistance in Switzerland: a 10-year molecular epidemiology survey. AIDS 2007; 21:2223-9.





Materialentnahme und Versand, Probenaufbewahrung
A. Materialentnahme und Versand
  • Für alle Untersuchungen von Blutproben kann EDTA-Blut eingesetzt werden. Jedes Untersuchungsmaterial muss mit der Patientenidentifikation, der Art des Untersuchungsmaterials (EDTA-Blut, Plasma, Serum, Liquor etc.), sowie dem Entnahmedatum beschriftet sein. 

  • Bei Jugendlichen und Erwachsenen reichen 10 mL EDTA-Blut für alle Untersuchungen. Bei Kleinkindern sind 2-5 mL einzusenden. Für die MEGA-PCR werden 4x10 mL benötigt. Auch bei einem erwarteten niedrigen Virus Load sind generell grosse Proben (2 Vacutainer à 10 mL) einzusenden. 

  • Entnahme der Blutprobe in EDTA-Vacutainer bzw. Vacutainer CPT (lila Stopfen) aus unserer Versandpackung. Der Stopfen muss mit Nadel perforiert werden; er darf keinesfalls entfernt werden (Sterilität!). Versandpackungen mit Vacutainern können gratis angefordert werden (Tel. 044-634-2632). 

  • Für "Virus Load", neben EDTA-Blut, sind auch Vacutainer CPT möglich, müssen aber direkt nach der Entnahme und VOR dem Versand in einem Ausschwingrotor gemäss den beiliegenden Instruktionen zentrifugiert werden. Falls Sie keine solche Zentrifuge haben, benützen Sie bitte die normalen EDTA-Vacutainer. 

  • Drogenutensilien (Injektionsnadeln, Spritzen) für HIV-Untersuchungen per Western Blot müssen mit der Nadel nach unten in einem verschlossenen festen Plastikröhrchen eingesandt werden. 

  • HIV-1 Antigentest und Virus Load (RNA) sowie der PERT Assay können auch an Liquor durchgeführt werden. Einsendung im Liquor- bzw. im nicht-antikoagulierten Vacutainer. Heparin-Röhrchen dürfen nicht verwendet werden. 

  • VERSAND STETS PER EXPRESS - KEINE ENTNAHMEN UND EINSENDUNGEN AM FREITAG UND VOR FEIERTAGEN !

B. Probenaufbewahrung

Alles nicht aufgebrauchte Untersuchungsmaterial wird während mindestens 12 Monaten aufbewahrt. Wenn EDTA-Blut eingeschickt wurde, werden Plasma und Zellpellets bei -70°C aufbewahrt. Wenn lediglich Plasma oder Serum eingesandt wurden, werden Reste bei -20° gelagert. Nach Ablauf von 12 Monaten werden alle aufbewahrten Materialien für NZR-interne Forschungsuntersuchungen freigegeben oder entsorgt.

Proben, die im Rahmen der MoCHiv -Studie eingesandt wurden, werden permanent für wissenschaftliche Projekte im Rahmen dieser Studie aufbewahrt (Koordinationszentrum):


Prof. Dr. med. Christoph Rudin
Universitäts-Kinderspital beider Basel
Römergasse 8
CH-4005 Basel

Tel. 061/685-6565
Fax 061/685-6566






Untersuchungsberichte und Auskünfte
A. Endbericht.

Im Endbericht werden sowohl die einzelnen Resultate aller durchgeführten Untersuchungen aufgeführt als auch eine Gesamtinterpretation gegeben. Diese bezieht sämtliche mit diesem Material durchgeführten Untersuchungen mit ein. Sofern die Identität bekannt ist, kann die Gesamtinterpretation auch frühere Untersuchungsergebnisse des Patienten berücksichtigen.

B. Zwischenbericht.

Falls Untersuchungen längere Zeit benötigen (z.B. Viruskulturen), wird ein Zwischenbericht mit den bereits erhobenen Resultaten (Serologie, PCR) verschickt. Der Zwischenbericht enthält keine Gesamtinterpretation.

C. Resultate.

Die Resultate der einzelnen Untersuchungen sind entweder POSITIV (POS), NEGATIV (NEG), INDETERMINAT (IND) oder, wenn ein Testversagen vorliegt, NULL (0). Bei quantitativen Untersuchungen (Virus Load) wird gleichzeitig ein Konzentrationswert angegeben. Die Messungenauigkeit bei quantitativer PCR kann bis einen Faktor 3 bzw. ein halbes log10 betragen.

D. Gesamtinterpretation.

Diese unterscheidet für diagnostische Fragestellungen die folgenden Möglichkeiten:
  • INFEKTION SICHER NACHGEWIESEN
  • KEIN HINWEIS AUF INFEKTION
  • INFEKTION MÖGLICH - muss durch Untersuchungen an neuer Probe weiter abgeklärt werden
  • DER ERHOBENE UNKLARE BEFUND SPRICHT NICHT FÜR EINE INFECTION
  • SPEZIELLE BEMERKUNGEN
 Bei Resistenzanalysen wird ein ausführlicher Bericht über die vorgefundenen Mutationen sowie die zu erwartende Wirksamkeit einzelner Medikamente erstellt.

E. Erwachsene Patienten.

Bei Erwachsenen ist ein nach den NZR-Kriterien positiver Western Blot, ein bestätigt positiver Antigentest oder eine positive PCR für die Diagnose einer Infektion mit dem jeweiligen Retrovirus ausreichend, vorausgesetzt, dass das Resultat nicht aufgrund eines Artefakts (Verwechslung oder Kontamination) zustande kam. Daher muss auch eine Gesamtinterpretation "INFEKTION SICHER NACHGEWIESEN" mit einem neu entnommenen und direkt an uns eingesandten Untersuchungsmaterial abgesichert werden.

Positivität ausschliesslich im PERT Assay ist vereinbar mit einer Infektion durch ein bisher unbekanntes Retrovirus, doch kommen auch unspezifische Ursachen in Frage. In solchen Fällen ist eine grössere Menge Untersuchungsmaterial zur Bestätigung und für die weiteren Abklärungen erforderlich.

F. Pädiatrische Patienten.

Für die diagnostische Beurteilung (Fragestellung: ist ein Kind HIV-infiziert?) haben die verschiedenen Formen des direkten Virusnachweises das grösste Gewicht. In der Regel stimmen die Resultate von Antigentest, RNA-PCR und allenfalls qualitativer DNA-PCR überein. Bei positiven Resultaten von mindestens zwei dieser drei Tests kann die Anwesenheit von HIV-1 im untersuchten Material als gesichert gelten. Eine Bestätigung des positiven Befunds anhand eines umgehend neu entnommenen Untersuchungsmaterials ist jedoch unerlässlich, um eine Verwechslung auszuschliessen. Die Kombination von bestätigt positivem Antigentest und positiver DNA- oder RNA-PCR ermöglicht heute eine sichere Erfassung der pädiatrischen HIV-Infektion innerhalb der ersten Lebenswochen. So ist es möglich, infizierte Kinder einer frühzeitigen antiretroviralen Therapie zuzuführen.






Aktualisierung: 02/2008
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